炎症刺激により、動脈ブタ内皮細胞からのヘパラン硫酸の脱落が誘発されるが、静脈ブタ内皮細胞からのヘパラン硫酸脱落は誘発されず、異なる炎症促進性および凝固促進性反応が引き起こされる

Aug 25, 2023

Scientific Reports volume 13、記事番号: 4483 (2023) この記事を引用

645 アクセス

8 オルトメトリック

メトリクスの詳細

内皮機能不全は、炎症誘発性および凝固促進性の内皮細胞 (EC) 表現型によって定義される血管損傷の初期イベントです。内皮糖衣の破壊は血管損傷と関連しているが、さまざまな炎症刺激が糖衣にどのような影響を与えるのか、また動脈細胞と静脈細胞の反応が異なるのかどうかは不明である。 3Dラウンドチャネルマイクロ流体システムを使用して、ブタの動脈および静脈EC上の内皮糖衣、特にヘパラン硫酸（HS）を調査しました。ヘパラン硫酸（HS）/糖衣の発現は、静脈 EC では静的条件下ですでに観察されていましたが、動脈細胞では流れに依存していました。さらに、炎症性合図による刺激後のHS/糖衣反応の分析により、動脈ECではなく静脈ECがHS脱落に耐性があることが明らかになりました。この所見は、隔離されたブタの血管でも観察されました。静脈 EC 上の HS の持続は、腫瘍壊死因子 α またはリポ多糖による刺激後の補体沈着と血餅形成を防止しましたが、異種間活性化後は糖衣を介した保護は観察されませんでした。反対に、動脈細胞上の HS の脱落は、炎症性損傷がなくても、炎症促進性および凝固促進性の表現型を誘導するのに十分でした。我々のデータは、動脈および静脈のECの二形性反応が部分的には異なるHS/糖衣動態によるものであることを示しており、動脈および静脈の血栓炎症性疾患には標的療法が必要であることが示唆されています。

内皮細胞 (EC) は血管の内層を構成し、血管の恒常性を調節するだけでなく、抗炎症性および抗凝固性の血管表現型を維持するために重要です1。血管障害では、内皮機能不全 2,3 によりこの恒常性が乱れ、血管の完全性の喪失と透過性の増加 4、一酸化窒素 (NO) 5 などの血管作動性物質の放出の減少、さらには血栓形成性 6 や表面血栓の発現の変化が起こります。白血球の相互作用に影響を与える接着分子7,8。内皮機能不全は、EC の内腔表面を覆うタンパク質と糖の保護層である内皮糖衣の脱落と強く関連しています。内皮グリコカリックスの主成分は、ヘパラン硫酸 (HS) などのグリコサミノグリカン側鎖が豊富なシンデカンなどのプロテオグリカンです10。アンチトロンビン III (ATIII)、C1 阻害剤、H 因子などの多くの調節血漿タンパク質は、糖衣と相互作用する HS 結合ドメイン 11、12、13 を持っています。補体調節タンパク質であるファクター H がグリコサミノグリカンを介して細胞表面に結合することは、過剰な補体活性化から身を守るために重要です 14。一方、内皮糖衣へのATIIIの結合は、凝固タンパク質第XIa因子に対する阻害活性を強化し、それによって凝固カスケードの活性化をブロックします15。さらに、糖衣は、過剰な白血球の接着を阻害する非接着性シールドを EC の表面に形成し、それによって白血球の遊出と組織の炎症を軽減すると示唆されています 16。したがって、内皮糖衣、特にHSは、抗炎症性および抗凝固性の環境を維持することにより、血管恒常性の調節において重要な役割を果たしています。内皮糖衣の喪失は多くの疾患で報告されています17。例えば、高血圧、糖尿病、肥満などの心血管危険因子を伴う内皮機能不全は、細胞表面からの内皮糖衣の喪失、血栓症の増加、疾患の進行に直接関連しています18。

グリコカリックスの脱落は移植中にも発生し、移植片の生着不良や組織拒絶反応と関連しています19。これは部分的には、細胞表面からプロテオグリカンやHSを切断するヘパラナーゼやマトリックスメタロプロテイナーゼ9（MMP9）などのタンパク質分解酵素を上方制御する高レベルの炎症誘発性サイトカインTNFα20、21によるもので、血管完全性の障害や血管拒絶反応を引き起こします22、23。最近、人間の臓器提供者が不足しているため、研究は異種移植、つまり 2 つの異なる種の間での組織または臓器の移植に焦点を当てています。現在、ブタは最も有望な臓器提供者であると考えられています。異種移植では、ドナーブタ EC 表面の糖残基を標的とする、あらかじめ形成されたレシピエント抗体が糖衣脱落、補体沈着、内皮機能不全を誘発し、最終的に臓器拒絶反応に至ります 24,25,26。

異種移植とは別に、内皮糖衣の脱落が疾患の特徴であると考えられる別の炎症状態は敗血症である。そこでは、EC から脱落し、血漿中で測定される糖衣成分の量が、播種性血管内凝固症候群の発症 27 および患者の生存率の低下 28 と相関しています。

炎症状態が糖衣に損傷を与え、疾患を開始または伝播させることが示されているが、さまざまな血管床の EC 上の糖衣が炎症性傷害に対して異なる反応をするかどうか、またこれが EC の挙動に影響を与えるかどうかは不明である。動脈細胞と静脈細胞の凝固亢進状態の病態生理学的な違いが記載されています29。下大静脈の EC は、大動脈 EC と比較して、炎症誘発性サイトカイン TNFα30 に応答して接着分子の発現を強く上方制御します。 EC間のこの不均一性が細胞表面の糖衣パターンの違いによるものなのか、またこれが大動脈と比較して静脈におけるより強い内皮機能障害を引き起こすのかどうかはまだ不明である。我々は、糖衣動態の違いが内皮と調節タンパク質の相互作用に影響を与え、異なる血管床での異なる反応を引き起こすのではないかと仮説を立てています。

糖衣の動態が動脈細胞と静脈細胞で異なるかどうかを判断するために、ラウンドチャネル3Dマイクロ流体システムを使用して、初代ブタの動脈および静脈EC上の糖衣の発現パターンを比較します。私たちは、異種移植設定、TNFαおよびLPSを模倣するために、静的条件または流動条件下、およびヒト血清などのいくつかの炎症性刺激による刺激時における、生理学的糖衣機能11の維持における主要な役割を果たすHSの役割を分析することに焦点を当てています。糖衣と内皮機能不全の間の相互作用は、補体活性化、白血球接着、凝固カスケードの活性化を評価することによって分析されました。

初代大血管 EC は、安楽死後 4 ～ 8 か月齢の雌雄の在来種豚から得られたブタの胸部大動脈および大静脈から単離されました。 3R 原則に従って、容器はベルン大学内の他の研究グループによる終末実験に使用された動物から採取されました。これらの動物の全身麻酔は、プロポフォール (1 ～ 4 mg/kg) およびケタミン (1 mg/kg) によって提供され、プロポフォール (2 ～ 8 mg/kg/h) およびフェンタニル (5 ～ 30 g/kg/h) で維持されました。 )、ロピバカイン (0.5%) とモルヒネ (0.1 mg/kg) で追加の鎮痛を提供しました。動物の死は、心臓が体から除去された場合、またはロクロニウムの投与および人工呼吸器の中止後にEEG信号が少なくとも60秒間平坦な状態を維持した場合のいずれかとして定義された。動物実験と安楽死はスイス連邦規則に従って実施され、スイスのベルンにある州獣医局によって承認されました。動脈 EC は、加湿綿棒を使用して大動脈内腔から機械的に採取され、一方、静脈 EC は、コラゲナーゼ II (Worthington LS004174、純粋な DMEM 中 1.88U/ml) を使用した酵素消化によって大静脈から採取されました。細胞は、10％熱不活化ウシ胎児血清（FBS、Sigma F7542）および1％ペニシリン/ストレプトマイシン（P/S、Gibco 15140-122）を添加し、1％内皮を添加した完全培地（DMEM Glutamax、Gibco 21885-025）で増殖させました。増殖培地 2 サプリメントミックス (PromoCell C-39216) を使用し、線維芽細胞の過剰増殖を避けるために毎日監視します。コンフルエンスに達すると、細胞は表現型を特定され、凍結保存され、将来の実験のために保管されました。純度をチェックするために、EC マーカー CD31 およびフォンヴィレブランド因子、ならびにα平滑筋アクチンを染色することによって細胞の表現型を判定しました。 ECマーカーと10％未満のα平滑筋アクチンの両方を発現する培養物のみを使用した。表現型の変動を避けるために、継代 4 までは細胞のみを使用しました。すべての実験では、少なくとも 2 人の異なるブタのドナーからの EC を使用しました。

末梢血単核球 (PBMC) は、ヒトまたはブタの EDTA 抗凝固処理全血から密度遠心分離によって新たに単離されました。ヒトの血液サンプルはインフォームドコンセントを得て健康なボランティアから採取され、提供直後に匿名化されました。研究プロトコールはベルン州の地元倫理委員会によって承認され、実験はスイス連邦規則およびベルン大学のガイドラインに従って実施されました。 PBMC の分離では、まず血液を遠心分離して血漿を除去し、その後等量の PBS-2%FBS で置き換えました。希釈した血液をFicoll-Paque密度勾配遠心分離媒体(Cytivia 17144002)上に重層し、製造業者のプロトコールに従ってPBMCを単離した。続いて、PBMCをPBS-2%FBSで洗浄した。ヒト PBMC は単離後新たに使用しましたが、ブタ PBMC は後で使用するために 10% DMSO (ジメチルスルホキシド、Sigma D4540-100ML) を含む FBS 中で凍結させました。

直径 550 μm の 3D 円形断面チャネルを含むポリジメチルシロキサン (PDMS) マイクロ流体チップを、前述のように準備しました 31。マイクロ流体チャネルは、50μg/mlのフィブロネクチン(Merck FC010)および100μg/mlのコラーゲンII(Gibco A10644-01)でコーティングされた。次に、動脈および静脈 EC をフロー培地 (10% FBS、1% P/S、4% デキストラン、Sigma 31390-100G および 1% ウシ血清アルブミン、Sigma A7030-100G を含む DMEM) に播種しました (100 万細胞/ml)。 37 °C で一晩接着させます。コンフルエントになったら、各チャネルを蠕動ポンプ (Gilson minipuls 3) に接続しました。シリコンチューブを使用して、フローメディアをリザーバーから引き出し、セルに到達する前にバブルトラップを通過させました。蠕動ポンプは、2 dyn/cm2 または 12 dyn/cm2 (媒体の粘度 μ = 2.1 mPa s) の層流せん断応力を 72 時間生成するように調整されました。マイクロ流体チップは、37 °C、5% CO2 の加湿インキュベーター内で維持されました。新鮮な栄養素を供給するために培地を 24 時間ごとに交換しました。

マイクロ流体チャネルの場合、細胞を流動条件下または静的条件下で 72 時間培養し、その後 4% ホルムアルデヒド (Sigma 252549-500ML 原液 37%) で室温で 20 分間固定しました。 PBS-3%BSA を用いて室温で 1 時間ブロッキングした後、細胞を抗ヘパラン硫酸抗体 (Amsbio 370-255-1、クローン F58-10E4)、小麦胚芽凝集素 (WGA) レクチンとともに 4 °C で一晩インキュベートしました。 (Sigma L4895-2MG) PBS-1%BSA で希釈した N-アセチルグルコサミン (GlcNAc) およびシアル酸、抗ブタ CD31 抗体 (R&D MAB33871) および/またはポリクローナル抗ヒト補体成分 C3b/c (DAKO A0062) を染色します。 -0.05%Tween (Tween 20、AppliChem A4974,0250)。続いて、サンプルを二次抗体とともに室温で撹拌しながら 1.5 時間インキュベートしました: ヘパラン硫酸に対するヤギ抗マウス IgM AlexaFluor568 (Invitrogen A21043) またはヤギ抗マウス IgM AlexaFluor488 (Invitrogen A21042)、ヤギ抗ラット IgG AlexaFluor633 (Invitrogen A21094) またはCD31 の場合はヤギ抗ラット IgG AlexaFluor568 (Invitrogen A11077)、および/または C3b/c の場合はヤギ抗ウサギ IgG AlexaFluor633 (Invitrogen A21071)。二次抗体はすべて PBS-1%BSA-0.05%Tween で希釈しました。細胞核の染色には DAPI (Simga、32670-20MG-F) を使用しました。次に、マイクロ流体チップを洗浄し、Zeiss LSM710 AxioObserver または Zeiss LSM980 共焦点顕微鏡の 20 倍の対物レンズを使用して画像化し、Image J (バージョン 2.3.0/1.53q) を使用して分析しました。 GlcNAc/シアル酸および HS 染色は、Cheng et al.32 から適用された方法に従ってカバレッジを定量化することによって分析されました。定量化のために、バックグラウンドノイズを低減するために蛍光閾値が調整され、画像が白黒マスクに変換されました。 ImageJ を使用してチャネル領域と比較した白色領域の割合を測定し、この割合を糖衣の被覆率と同等とし、チャネルあたりの細胞数に正規化しました。サンプルごとに少なくとも 3 つの画像を分析しました。培養 EC を特徴付けるために使用されるチャンバースライドについては、上記と同じ手順が使用されました。次に、ProLong gold antifade reagent (Invitrogen P36934) を使用してスライドをマウントし、倍率 20 倍の蛍光顕微鏡 (Leica DMI4000B) で撮影しました。

新たに単離したブタの胸部大動脈および大静脈から正面血管を調製し、これらを1cm 2 片に切断し、4%ホルムアルデヒドで室温で20分間固定した。次いで、血管片をブロックし、上記のようにフォン・ヴィレブランド因子（DAKO A0082）、CD31、および糖衣成分について染色した。画像は共焦点顕微鏡 (Zeiss AxioObserver LSM710) で取得しました。

血管切片を得るために、新たに単離したブタ胸部大動脈および大静脈の環をTissueTek OCTコンパウンド(Sakura 4583)に包埋した。厚さ５μｍの切片を冷１００％アセトン（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ１４１００７．１２１１）で固定し、ＴＢＳで希釈した２０％ＮＨＳとともに３０分間インキュベートして、ＨＳ脱落および補体沈着を誘導した。対照切片はTBSのみでインキュベートしました。凍結切片をTBS-3%BSAでブロックし、染色し、上記のようにマウントした。画像は、倍率20倍の共焦点顕微鏡(Zeiss LSM980)で取得した。未固定の生きた細胞上の糖衣を画像化するために、マイクロ流体チャネルを 72 時間 (2 dyn/cm2 または 12 dyn/cm2) 灌流した後、上記のフローで説明した希釈液を使用して WGA レクチンとヘキスト核染色でフロー下で 30 分間染色しました。 FBS のないメディア。共焦点顕微鏡 (Zeiss LSM980) を使用して倍率 20 倍でチャネルを直ちに画像化しました。

72 時間の高せん断応力 (12 dyn/cm2) の後、細胞を未処理のまま放置するか、10% 正常ヒト血清 (健康なボランティアから収集) または 100 ng/ml の組換えヒト腫瘍壊死因子 α (TNFα) を加えた流動下で 2 時間インキュベートしました。、R&D 210-TA)、100 μg/ml リポ多糖 (LPS、Sigma L4391) または 5 U/ml ヘパリナーゼ I + III (Sigma H3917-100UN) を無血清フロー培地中、37 °C で 4 時間処理しました。 TNFα、LPS、およびヘパリナーゼ I + III で刺激された細胞上の補体沈着を評価するために、活性化の最後の 2 時間の間にチャネルを 10% ブタ血清でさらに灌流しました。固定後、サンプルを上記のように抗補体 C3b/c 抗体を使用して染色しました。

細胞を3D円形断面マイクロ流体チャネルに播種し、12dyn/cm2せん断応力条件下で72時間灌流した後、上記のように正常ヒト血清、組換えヒトTNFα、LPSまたはヘパリナーゼI + IIIで処理しました。チャネル内の EC の核は、Hoechst 3342 核染色 (Tocris 23491-52-3) を用いて流動下で染色されました。次に、ヒトまたはブタから単離した PBMC を、メーカーの指示に従って CFSE (ThermoFisher C34554) で標識し、デキストランを含まないフローメディアに再懸濁しました。各チャネルは、100万/mlの標識PBMCを0.2dyn/cm2のせん断応力で灌流し、20分間3秒ごとに写真を取得しました。分析用に、フレームレート 3 フレーム/秒のビデオファイルが作成されました。 PBMC接着は、少なくとも3秒間（すなわち、1フレーム）固定化された細胞の数として定義されました。細胞は、タイムラプス記録ごとに手動でカウントされました。チャネルは、ＰＢＭＣ灌流後に固定され、上記のようにＨＳについて染色された。

細胞を上記のように 3D 円形断面マイクロ流体チャネルに播種し、続いて 15 μg/ml AF488 標識した再石灰化ヒト (健康な匿名ボランティア由来) またはブタ (Merck P2891) クエン酸血漿を 12 dyn/cm2 のせん断応力で灌流しました。ヒトフィブリノーゲン (Thermofisher F13191)。フィブリノーゲンをスパイクした血漿は、イメージングの直前に 25 mM (ヒト血漿) または 13 mM (ブタ血漿) CaCl2 (Sigma 10043-52-4) を添加することによって再石灰化しました。灌流中、共焦点顕微鏡 (Zeiss LSM980) を使用して細胞を 5 秒ごとに最大 15 分間画像化しました。チャネルの完全な閉塞が生じたとき、またはチャネルの閉塞によりマイクロ流体システム内の圧力が上昇し、チャネル表面から細胞が完全に剥離したときに実験を終了した。オクルージョンまでの時間は、フレームレート 3 フレーム/秒のビデオファイルから決定されました。

すべてのデータセットは GraphPad Prism 9 ソフトウェアを使用して分析され、p < 0.05 が有意であると見なされました。 3 つ以上のグループを含むデータセットに対して、一元配置分散分析とそれに続くペアワイズ Tukey t 検定を使用した多重比較を実行しました。補体沈着については、PBCM 接着および凝固の二元配置分散分析を実行し、続いて Tukey および Bonferroni 事後分析を使用して多重比較を行いました。実験は、少なくとも 3 つの生物学的複製を使用して実行されました。

せん断応力がさまざまな糖衣成分の発現にどのように影響するかを決定し、炎症性疾患中の動脈および静脈のECの多様な挙動を糖衣が説明できるかどうかを調べるために、EC表面上の糖衣の被覆率を免疫蛍光によって分析しました。静脈細胞と動脈細胞は、3D ラウンドチャネルマイクロ流体システムで静的または層流せん断応力条件 (12 dyn/cm2 および 2 dyn/cm2) で 72 時間増殖させました 31。これらのせん断応力条件は、生体内データ 33 から報告された大動脈および大静脈の生理学的せん断応力値に従って選択されました。細胞は、N-アセチルグルコサミン (GlcNAc) およびシアル酸に結合する小麦胚芽凝集素 (WGA) レクチンを使用して染色されました ( Sia) 残基は内皮糖衣内に存在します。 WGA 染色は、血管内皮上の糖衣を特異的に標識、視覚化、定量するために広く使用されています 34,35。図1A〜Dに示すように、WGA染色（GlcNAc、Sia）は主に動脈ECと静脈ECの両方の層せん断応力時に観察されました。一方、生理学的抗炎症性および抗凝血性の維持に関与するECによって発現される主要な糖衣成分であるHSは、動脈細胞の流れに依存していましたが（図1E、F）、驚くべきことに、HSは静的条件下ですでに観察されていました。静脈 EC の表面 (図 1G、H)。これは、糖衣の動態が動脈細胞と静脈細胞で異なることを示しています。さらに、せん断応力の変化は HS 分布に影響を与えました。低せん断条件（2dyn/cm2）下では、HSはECの接合領域に沿って位置していましたが、高せん断応力が適用された場合、HSは細胞膜の異なる領域にクラスター化しました（図1E、G）。シンデカン-4 のような HS を含むプロテオグリカンのクラスター化は、特定の膜脂質ラフト領域で起こることが示されており、小胞輸送とシグナル伝達に重要です 36。

動脈および静脈内皮細胞上の糖衣/N-アセチルグルコサミン、シアル酸およびヘパラン硫酸の被覆に対するせん断応力の影響。静的条件下、低せん断応力 (2 dyn/cm2) または高せん断応力 (12 dyn/cm2) で培養された (A、E) 動脈または (C、G) 静脈のブタ内皮細胞を含むマイクロ流体チャネルの代表的な画像。細胞は、(A、C) N-アセチルグルコサミン (GlcNAc) およびシアル酸 (Sia) については緑色に、(E、G) はヘパラン硫酸 (HS) について赤色で染色されました。核は青色 (DAPI) で表示されます。すべての画像は Zeiss LSM710 共焦点顕微鏡で取得されました。スケールバー: 50 μm。 (B、D、F、H) 糖衣成分 (GlcNAc/Sia または HS) の範囲を、(B、D) GlcNAc および Sia または (F) について陽性の領域のパーセンテージとして各画像 (4 画像/条件/実験) について計算しました。、H) HS の場合、画像あたりの細胞の総数に正規化されました。データは 3 つ以上の独立した実験と 2 ～ 3 人の異なるブタ EC ドナーからのものです。統計分析には、多重比較を伴う一元配置分散分析が使用されました。

in vitro の EC が in vivo の EC と同様の表現型を持つことを確認するために、新たに単離したブタの胸部大動脈および大静脈を CD31 や vWF (フォンヴィレブランド因子) などの EC マーカーで正面から染色し、糖衣については両方の WGA で染色しました。レクチンと抗HS抗体。補足図S1に示すように、インビトロで増殖したECは、血管内でインビボのECと同様の表現型を示します。

糖衣の変化と HS の脱落はタンパク質結合の喪失を引き起こし、虚血再灌流傷害や移植中に観察されます。現在、世界的な臓器不足のため、2 つの異なる種間の臓器移植が強く検討されています 37。

したがって、動脈細胞と静脈細胞の間の糖衣動態の違いが異種移植のような炎症状態中に異なる反応を誘発するかどうかを判断するために、ブタの動脈および静脈のECを正常ヒト血清（NHS）で灌流して、インビトロでの異種移植環境を模倣しました。 α-ガラクトース24などのEC表面上に発現する異種抗原に対する、予め形成された異種反応性抗体の結合は、ECグリコカリックス38の脱落を誘導し、移植片拒絶につながることが示されている。我々は、NHSで刺激された動脈ECの表面からHSが脱落することを観察しました（図2A、B;（-）および血清）。これは、ECと白血球の相互作用に部分的に関与する重要な接着分子であるE-セレクチンの発現の増加と相関していました（補足図S2A;（-）および血清）。驚くべきことに、NHS による静脈 EC の刺激は HS 脱落を誘発しませんでした。活性化および非活性化 EC の両方で 16 ～ 18% の HS 被覆率が観察されました (図 2C、D; (-) および血清)。ただし、動脈ECに関しては、NHSとのインキュベーション後にE-セレクチン発現が増加しました（補足図S2B）。 HS が実際に静脈細胞の表面から脱落することを確認するために、EC に HS を特異的に切断する酵素であるヘパリナーゼ I + III を灌流しました。図２Ａ、Ｃに見られるように、ヘパリナーゼとのインキュベーションにより、動脈細胞および静脈細胞からそれぞれＨＳの約５０％（図２Ｂ）および７０％（図２Ｄ）が除去される。 GlcNAcやシアル酸などの他の糖衣成分は、NHSの影響を受けず（補足図S3A、B）、予想されたようにヘパリナーゼ処理によっても影響を受けませんでした（補足図S3C）。

異種の活性化静脈細胞上でのヘパラン硫酸脱離の抵抗性は、C3b/c 沈着を妨げません。 (A、C) 10% 正常ヒト血清 (血清) または 5 U/ml ヘパリナーゼ (ヘパリナーゼ) で灌流した未処理 (-) の細胞の細胞表面上のヘパラン硫酸 (HS) の代表的な画像。 HS は赤、核は青で示されています (DAPI)。スケールバー: 50 μm (B、D) HS の脱落を、HS 陽性領域のパーセンテージとして各画像 (4 画像/条件/実験) について定量化し、画像あたりの細胞の総数に対して正規化しました。 (E、G) 10% 正常ヒト血清 (血清) または 5 U/ml ヘパリナーゼ (ヘパリナーゼ) で灌流した、未処理 (-) のまま放置された細胞の細胞表面上の補体 C3b/c 沈着の代表的な画像。 C3b/c は黄色で示され、核は青色で示されます (DAPI)。スケールバー: 50 μm (F、H) C3b/c 沈着を、C3b/c 陽性細胞のパーセンテージ/細胞の総数/画像 (4 画像/条件/実験) として測定しました。データはフィジーソフトウェアで定量化されました。すべての画像は Zeiss LSM980 共焦点顕微鏡で取得されました。データは 3 つ以上の独立した実験と 2 ～ 3 人の異なるブタ EC ドナーからのものです。統計分析には、多重比較を伴う一元配置分散分析が使用されました。

我々の観察が培養ECのみに限定されていないことを確認するために、新たに単離したブタ胸部大動脈および大静脈の凍結切片をex vivoでNHSで処理し、HS範囲について分析した。繰り返しになりますが、動脈からのHSの脱落は観察されましたが、静脈からは脱落しませんでした（補足図S4）。さらに、固定による糖衣被覆率のアーティファクトの可能性を排除するために、未固定の生細胞に対して GlcNAc/Sia 染色を実行しました。補足図S5に示すように、GlcNAc / Siaの適用範囲は、低せん断応力条件および高せん断応力条件下で、生および固定された動脈および静脈ECの両方で同等です。さらに、実験設定で使用される高せん断応力が、通常より低いせん断環境を必要とする静脈 EC からの HS 脱落を妨げないことを確認するために、NHS 灌流を静脈せん断応力条件 (2 dyn/cm2) で実施しました。。もう一度言いますが、HS は動脈細胞の表面からのみ脱落しました（補足図 S6A-D）。

HS の脱落は、補体の沈着、白血球の接着および凝固を起こしやすい炎症誘発性 EC 表現型に関連付けられています。

動脈細胞と静脈細胞の両方における補体沈着は、12 dyn/cm2 のせん断応力で NHS で細胞を灌流した後、免疫蛍光によって評価されました。より高いせん断応力の選択は、せん断が EC 上の補体受容体の発現を強化し、補体沈着のより良好な視覚化を可能にするという観察に基づいています 39。活性化された補体カスケードの 3 つの経路はすべて、シグナル増幅が起こる補体系の必須構成要素である C3 のレベルで結合します 40。したがって、補体 C3 転換酵素による C3 切断の産物である C3b/c の沈着が、補体活性化のマーカーとして使用されました。興味深いことに、内皮糖衣の脱落はNHS活性化動脈細胞からのみ観察されましたが（図2A〜D）、補体C3b/cの沈着は両方の細胞タイプで観察されました（図2E〜H）。静脈細胞は補体の沈着を防ぎません。 HS の除去が補体沈着を促進するかどうかを決定するために、細胞をヘパリナーゼで処理しました。動脈細胞および静脈細胞への C3b/c の結合は、NHS 刺激細胞と比較して増加せず（図 2E-H）、静脈細胞上の HS が異種移植セットアップにおける補体沈着の調節に役割を果たしていないことが確認されました。

細胞表面上の補体沈着がHSの脱落を促進するかどうかを調べるために、チャネルを熱不活化NHS（HI血清）で灌流しました。熱は補体系の活性化をブロックするため、C3b/c の最小限の沈着のみが期待されます。熱不活化NHSと動脈細胞と静脈細胞の両方をインキュベートしても、HSの脱落（補足図S7A〜D）およびC3b / cの沈着（補足図S7E〜H）は誘導されませんでした。これは、補体系を不活化することによって動脈細胞からのHS脱落が大幅に減少する可能性があることを示しており、動脈細胞上の補体沈着がHS脱落と相関していることを示唆しています。

次に、ヒト PBMC の異種活性化ブタ EC への結合を評価しました。 PBMC の接着は、少なくとも 3 秒間細胞表面に結合する白血球の数として定量化されました。動脈細胞と静脈細胞に結合する同量の PBMC が検出されました (図 3A ～ C)。補足図S2に示すように、NHSでの灌流後、E-セレクチンは動脈細胞と静脈細胞の両方で発現します。

異種間活性化後の静脈細胞上のヘパラン硫酸の残留は、白血球の接着および血栓形成を防ぐことができない。 (A、B) 未処理 (-) またはいずれかで灌流された (A) 動脈および (B) 静脈ブタ内皮細胞へのヒト末梢血単核球 (PBMC; 緑色で表示) の結合の 3 つのタイムラプス記録の代表的な画像10% 正常ヒト血清 (血清) または 5 U/ml ヘパリナーゼ (ヘパリナーゼ)。細胞の核は青色で示されています（Hoechst）。スケールバー: 50 μm。 (C) 接着 PBMC は、3 秒以上固定された細胞を計数することにより、4 つの独立した実験の 20 分間のタイムラプス記録から定量されました。 (D、E) (D) 動脈または (E) 静脈のブタ EC 上に形成されるフィブリン凝固 (緑色) の代表的な画像。細胞を未処理のままにするか (-)、AlexaFluor488 標識ヒトフィブリノーゲンをスパイクした再石灰化クエン酸ヒト血漿 (緑色) を添加する前に、10% 正常ヒト血清 (血清) または 5 U/ml ヘパリナーゼ (ヘパリナーゼ) で灌流しました。スケールバー: 200 μm。 (F) 閉塞までの時間を完全なチャネル閉塞または細胞剥離として決定し、血漿灌流チャネルの微速度記録から定量化しました。データは 2 ～ 3 人の異なるブタ EC ドナーによる 4 つの独立した実験からのもので、フィジーソフトウェアを使用して分析されました。 Tukey および Bonferroni 事後検定による二元配置分散分析を統計分析に使用しました。

炎症刺激の非存在下での HS 脱落が白血球結合を引き起こすかどうかを調べるために、EC をヘパリナーゼで処理しました。ヘパリナーゼはECを活性化せず、実際、どちらの細胞型の細胞表面にもE-セレクチンは発現されませんでした（補足図S2）。予想外なことに、ヘパリナーゼ処理された動脈細胞ではなく静脈細胞からのHSの脱落は、ヒトPBMCの接着を誘導するのに十分であった(図3C)。これは、E-セレクチンの発現が白血球の静脈 EC への結合に必須である一方、HS が動脈 EC への PBMC の接着に影響を与えることを示しています。

次に、蛍光標識ヒトフィブリノーゲンを添加した再石灰化ヒト血漿を動脈細胞と静脈細胞の両方に灌流することにより、血栓形成に対するHS脱落の影響を分析しました。図 3D-F に示すように、NHS で活性化された動脈および静脈 EC の凝固形成までの時間は、未処理の細胞と比較してそれぞれ約 50% および 40% 減少しました (図 3F)。これは、静脈上の無傷の HS が示唆されています。細胞は凝固を妨げません。興味深いことに、未処理の動脈細胞の凝固形成時間は 8 分でしたが、静脈細胞を含むチャネルは 5 分後にすでに閉塞していました (図 3F)。これは、これら 2 つの細胞型の間に凝固時間に根本的な違いがあることを示しています。

凝固におけるHSの役割をさらに調査するために、フィブリノーゲンをスパイクしたヒト血漿で灌流する前に、細胞をヘパリナーゼで処理しました。図3D〜Fに示すように、HS脱落により動脈ECが播種されたチャネルの閉塞までの時間が短縮されましたが、静脈細胞には影響は観察されませんでした。これは、動脈細胞からの HS の除去が凝固促進表現型を誘導するのに十分であることを示唆しています。

静脈細胞が異なる炎症誘発性条件下でもHS脱落に耐性があるかどうかを判断するために、TNFαおよびLPSでECを刺激し、上記のようにHS被覆率を測定しました。 HS の脱落は、TNFα および LPS で活性化された動脈 EC では観察されましたが (図 4A、B)、やはり活性化された静脈 EC では観察されませんでした (図 4C、D)。実際、HS は、対照と比較して、TNFα および LPS で処理した動脈細胞の細胞表面ではそれぞれ 41% および 30% 減少しましたが (図 4B)、静脈 EC の表面では変化しませんでした (図 4D)。

TNFαまたはLPSによる刺激後の静脈細胞上の無傷のヘパラン硫酸は、補体の沈着を防ぎます。 (A、C) 未処理のまま放置された細胞 (-)、または 100 ng/ml TNFα、100 μg/ml LPS、または 5 U/ml ヘパリナーゼ (ヘパリナーゼ) のいずれかで灌流された細胞の代表的な画像。ヘパラン硫酸 (HS) は赤色で示され、核は青色 (DAPI) で示されます。スケールバー: 50 μm。 (B、D) HS の脱落は、HS 陽性領域の割合として各画像 (4 画像/条件/実験) で定量化され、画像あたりの細胞の総数に対して正規化されました。 (E、G) 未処理 (-) または 100 ng/ml TNFα、100 μg/ml LPS、または 5 U/ml ヘパリナーゼ (ヘパリナーゼ) のいずれかで灌流した細胞の細胞表面上の補体 C3b/c の代表的な画像。 C3b/c は黄色で示され、核は青色で示されます (DAPI)。スケールバー: 50 μm (F、H) C3b/c 沈着を、C3b/c 陽性細胞のパーセンテージ/細胞の総数/画像 (4 画像/条件/実験) として測定しました。 Tukey および Bonferroni 事後検定による二元配置分散分析を統計分析に使用しました。データは、2 ～ 3 人の異なるブタ EC ドナーによる 3 つ以上の独立した実験からのもので、フィジーソフトウェアを使用して分析されました。

EC 表面上の HS の持続により細胞が抗炎症表現型を維持できるかどうかを評価するために、EC を正常なブタ血清 (NPS) で灌流し、補体沈着を評価しました。図4E〜Hで観察されたように、刺激されていないECの表面では少量のC3b/cが検出されました。これは、異なるドナーから得られた EC と NPS の間の免疫学的不一致によって引き起こされる可能性があります。ＴＮＦαまたはＬＰＳによる動脈細胞の刺激により、Ｃ３ｂ／ｃ沈着がそれぞれ約２５％および３０％増加し（図４Ｆ）、動脈細胞からのＨＳの脱落が抗炎症特性の喪失と相関することが確認された。一方、TNFαまたはLPS活性化静脈細胞をNPSで灌流しても補体沈着は起こらず（図4H）、これらの炎症状態では静脈細胞上のHSが保護的であることを示唆しています。 HS の保護的役割をさらに確認するために、動脈 EC と静脈 EC の両方にヘパリナーゼを灌流しました。図4に示すように、ヘパリナーゼによる細胞表面からのHSの酵素的除去（図4A〜C）は、動脈および静脈ECの両方でC3b / cの沈着を誘導するのに十分でした（図4F、H）。

次に、TNFαとLPSで活性化された動脈細胞と静脈細胞の間で観察されたHS動態の違いが、白血球との相互作用に影響を与えるかどうかを調査しました。このために、TNFα または LPS で活性化された動脈および静脈 EC を蛍光標識されたブタ PBMC で灌流しました。活性化された動脈 EC と静脈 EC の両方で PBMC 結合の増加が観察されました (図 5A ～ C)。これは、E-セレクチンの細胞表面発現と相関していました（補足図S2B）。総合すると、これは、HSが静脈ECの表面から脱落しないにもかかわらず（図2C、D）、E-セレクチンの発現の増加がPBMCの接着を可能にするのに十分であることを示唆しています。実際、静脈細胞上でのPBMC灌流前のヘパリナーゼによるHSの脱落はPBMC接着を増加させなかったが、動脈細胞上では、事前の活性化なしのHSの除去はPBMC結合を誘導するのに十分であった（図5A、C）。

TNFα または LPS で活性化された静脈内皮細胞上の無傷のヘパラン硫酸は、白血球の接着を妨げず、血栓形成を防ぎます。 (A、B) ブタ末梢血単核球 (PBMC、緑色で表示) と、(A) 未処理 (-) またはいずれかで灌流された (A) 動脈および (B) 静脈ブタ内皮細胞との結合の 3 つのタイムラプス記録の代表的な画像100 ng/ml TNFα、100 μg/ml LPS、または 5 U/ml ヘパリナーゼ (ヘパリナーゼ)。細胞の核は青色で示されています（Hoechst）。スケールバー: 50 μm。 (C) 接着 PBMC は、3 秒以上固定された細胞を計数することにより、4 つの独立した実験の 20 分間のタイムラプス記録から定量されました。 (D、E) (D) 動脈または (E) 静脈のブタ内皮細胞上に形成されるフィブリン凝固 (緑色) の代表的な画像。細胞を未処理のままにするか(-)、100 ng/ml TNFα、100 μg/ml LPS、または5 U/ml ヘパリナーゼ(ヘパリナーゼ)のいずれかで灌流しました。細胞の核は青色で示されています（Hoechst）。スケールバー: 200 μm。 (F) 閉塞までの時間を完全なチャネル閉塞または細胞剥離として決定し、AlexaFluor488 標識フィブリノーゲン (緑色) をスパイクした血漿灌流チャネルのタイムラプス記録から定量しました。データは 2 ～ 3 人の異なるブタ EC ドナーによる 4 つの独立した実験からのもので、フィジーソフトウェアを使用して分析されました。 (C) Tukey および Bonferroni 事後検定を使用した二元配置分散分析、または (F) 多重比較を使用した一元配置分散分析を統計分析に使用しました。

TNFαまたはLPSによる刺激後の静脈細胞上のHSの持続は補体の沈着を防ぐことができたので、我々は血栓形成も損なわれるかどうかを調べた。このために、静脈細胞と動脈細胞を未処理のままにするか、TNFα、LPS、またはヘパリナーゼで活性化し、AlexaFluor488蛍光標識フィブリノーゲンをスパイクした再石灰化正常プール血漿で灌流しました。図 5D ～ F に示すように、血栓形成までの時間は動脈 EC でのみ短縮され、静脈 EC では短縮されませんでした (図 5F)。これは、静脈細胞上のHSが抗凝固状態の維持に関与していることを示しています。しかし、ヘパリナーゼは血栓形成の増加を引き起こさないため、これらのデータは、静脈血栓症を促進するには、内皮層への損傷や凝固促進組織因子発現の誘導などの他のヒットが必要であることを示唆しています。

内皮の糖衣の脱落は多くの炎症状態で観察されています 18,22,23,27 が、動脈または静脈の細胞に対する炎症の影響や糖衣の破壊に関する結果はほとんどわかっていません。今回、我々は、静脈と動脈の EC 上の糖衣が、せん断応力と炎症の合図の両方に対して異なる反応を示すことを示します。せん断応力は糖衣の発達に影響を与えることが知られています41、42、43、44、45。動脈細胞の流れの減少または障害は、アテローム性動脈硬化を促進するアテローム生成促進表現型46、47、48だけでなく、炎症や凝固を引き起こす糖衣の機能に影響を与える糖衣の厚さの減少49にも関連しています。我々は、異なるせん断応力条件下で、ブタの動脈および静脈の EC 上で、特に HS について、明確な糖衣の動態が存在することを発見しました。動脈細胞上の HS は流動下でのみ発現しますが、静脈細胞上では静的条件下でも存在します (図 1)。私たちはグリコサミノグリカン（GAG）側鎖の発現を調査してきましたが、せん断応力がさまざまなGAG側鎖のアンカーポイントであるコアタンパク質にどのような影響を与えるのかはまだ不明です。静的条件下で発現されたコアタンパク質は、流動下とは異なる N-置換 (抗 HS 抗体で染色) および N-非置換 (WGA レクチンで染色) 二糖単位のセットによって修飾されている可能性があり、HS の存在を説明しています。しかし、静的条件下では静脈 EC 上の GlcNAc/Sia の発現は低い。静的および流動条件下での特定の GAG 側鎖に加えてコアタンパク質を調査するには、さらなる研究が必要です。さらに、細胞表面上の HS の分布は、せん断応力の変化の影響を受けます。 HS は、高せん断条件下では特定の細胞膜領域にクラスター化しますが、低せん断条件下では細胞接合部に沿って分布します (図 1)。シンデカン-4 などの糖衣成分の脂質ラフトへの再分布は Zeng らによって観察され 41、シグナル伝達分子の凝集を可能にし、シグナル伝達を誘導することが示唆されました。興味深いことに、脂質が豊富な接合膜領域への HS クラスタリングは、SARS-CoV 2 ウイルスの宿主細胞への侵入を促進することも示されました 50。したがって、動脈または静脈 EC 上の HS 分布の変動により、細胞活性化またはウイルス感染に対する異なる素因が決定される可能性があります。

動脈細胞と静脈細胞の間の糖衣の動態は、EC 活性化時にも異なります。以前の研究 22、23、25、26、51、52、53 と一致して、我々は正常ヒト血清、TNFα、および LPS で刺激された動脈細胞の細胞表面からの HS の脱落を観察しました。驚くべきことに、静脈細胞上のHSは影響を受けなかった(図2、3)。これは、静脈EC上のHSが脱落しにくいか、脱落から保護されているかのいずれかを示唆している。糖衣の脱落は主に、TNFα で活性化された EC 23 や敗血症、その他の炎症状態の際に上方制御されるマトリックスメタロプロテイナーゼ (MMP) によって媒介されます 54。 MMP 活性は、炎症中に増加するマトリックスメタロプロテイナーゼの組織阻害剤 (TIMP) によって生理学的に制御されます 55。静脈細胞ではなく動脈細胞ではMMPの発現が変化していないこと、および/またはTIMPの活性が維持されていることは、脱落に対する感受性の違いを説明できる可能性があるが、ヒト血清、TNFα、またはLPSによる活性化後のMMP2およびTIMP1の発現の変化は観察されなかった（データ）図示されていない）。他のMMPおよびTIMPの発現を分析し、静脈内皮糖衣の脱落に対する抵抗性の背後にあるメカニズムを特定するには、さらなる研究が必要です。

活性化された静脈 EC 上での HS の持続は、内皮活性化時に抗炎症特性と抗凝固特性が保持されることを意味します。これにより、静脈は動脈よりも血管損傷に対して潜在的に耐性が高くなります。実際、我々は、動脈細胞はHS依存性の抗炎症および抗凝固表現型を有する一方、静脈細胞上に保存されたHSは、異なる炎症刺激を比較した場合にさまざまな機能的結果をもたらすことを実証した。静脈細胞上のHSは、TNFαまたはLPSが内皮活性化に使用された場合にのみ、補体の沈着および凝固から保護しました（図4、5）。 HS のこの保護的役割は、異種移植セットアップが使用された場合には観察されませんでした (図 2、3)。これは、強い炎症反応を誘発する異種移植設定中に複数の炎症刺激が同時に存在するためである可能性があります。実際、Wünsch et al.56 は、ブタの動脈 EC は、古典的な炎症誘発性サイトカインと比較して、ヒト血清に対して持続的な細胞内カルシウム応答を引き起こすことを実証しています。

動脈および静脈 EC 上の補体沈着の違いは炎症刺激に依存しますが、PBMC 接着は両方の細胞タイプで一貫して発生しました (図 3、5)。静脈細胞へのPBMCの結合は、E-セレクチンの細胞表面発現と相関していましたが（補足図S2）、興味深いことに、ヘパリナーゼ処理によってHSが細胞表面から単に除去された非炎症条件下でも、動脈細胞への接着が観察されました。これは、動脈細胞からの HS の脱落が白血球接着を誘導するのに十分であることを示唆しています。動脈細胞に対するヘパリナーゼ処理が E-セレクチン以外のさらなる接着分子を露出させるかどうかは不明です。

白血球の接着における糖衣の脱落の重要性は議論の的となっている。一方で、無傷の糖衣の厚さは通常接着分子の長さを超えるため、無傷の糖衣はセレクチンを遮蔽し、白血球の結合を防ぐことができます57。一方、糖衣はケモカインを隔離して局所濃度の上昇を維持し、白血球の動員を促進します58。白血球の接着と血管外遊出は通常細静脈で起こるため 59、静脈 EC は積極的に糖衣を維持してケモカインの隔離を促進し、炎症時の白血球の動員を媒介する可能性があると考えられます。この仮説を検証するには、ケモカインや炎症刺激を含む研究が必要となるでしょう。対照的に、動脈 EC 上の HS 脱落は糖衣の厚さを減少させ、それによって接着分子を露出させ、白血球接着の増加につながる可能性があります。興味深いことに、McDonald et al.17 は、炎症刺激がなくてもフロー培養した動脈 EC から糖衣を酵素的に除去すると、ICAM-1 発現と白血球接着が増加したことを示しています。これは、HS 脱落が糖衣の厚さを減少させるだけでなく、動脈 EC 上の接着分子発現の増加にもつながる可能性があることを示唆しています。しかし、静脈血管の場合、炎症刺激後に糖衣が脱落することなく白血球の結合が起こることが示されています60。これは、糖衣の厚さ以外の要因、一例として糖衣の密度が役割を果たす可能性があることを示唆しています。 Platts et al.61 は、虚血/再灌流傷害後に毛細血管後細静脈の糖衣が「緩み」、蛍光色素が EC 層の近くに浸透できるようになることを示唆しています。この現象は循環白血球にも当てはまる可能性があります。静脈 EC 上の糖衣がより「緩い」と、糖衣が無傷であっても PBCM が結合できる可能性があります。糖衣の被覆率に関する我々のデータは、動脈細胞よりも静脈の被覆率が低いことを示しており、静脈の糖衣の密度が低く、おそらく白血球の接着をより許容していることを示唆しています。糖衣の被覆がより密である動脈 EC では、脱落により白血球結合に関与する接着分子が露出する可能性があります。

グリコカリックスの脱落は、凝固促進性 EC 表現型を誘導することも知られています。実際、動脈細胞からの HS の脱落により血栓形成が増加することが観察されました (図 3、5)。この場合も、ヘパリナーゼ処理は、この凝固促進性 EC 表現型を誘導するのに十分でした。対照的に、HSが保存されている静脈ECでは、凝固は異種活性化後にのみ観察され、TNFαまたはLPSによる刺激後には凝固は発生しませんでした（図3、5）。炎症誘発性サイトカインとエンドトキシンは血栓促進作用があると考えられていますが 62,63、TNFα は静脈血栓症を直接誘発しません 64,65。 TNFα 受容体ノックアウトマウスも、下大静脈結紮後に血栓を発症します 65。これは、炎症誘発性サイトカインではなく、組織因子のような血栓形成促進タンパク質の表面発現の変化が静脈血栓症を引き起こす可能性があることを示唆しています66。

私たちの発見を総合すると、動脈細胞はHSの脱落を受けやすいことを示しています。実際、動脈細胞表面からの HS の除去は、炎症および血栓反応を開始するのに十分です。その代わり、HSが維持されている静脈細胞は、抗炎症性および抗凝固性の表現型を失うために、糖衣の脱落に加えてさらなる「ヒット」を必要とします。したがって、これは、動脈 EC と比較して、静脈 EC が炎症性傷害に対して潜在的により耐性があることを示唆しています。細胞タイプごとに異なる治療アプローチを考慮する必要があります。動脈 EC では脱落した HS の補充が有益ですが、静脈 EC では糖衣の回復を目的としない他のアプローチを考慮する必要があります。静脈HS排出抵抗性の背後にあるメカニズムを理解するには、さらなる研究が必要です。

マイクロ流体システムは in vitro 研究で人気が高まっていますが、そのようなシステムは依然として in vivo の状況とは異なる可能性があることに言及することが重要です。また、上記の研究は大血管 EC に焦点を当てているが、糖衣動態の不均一性に関する現在の知識を拡張するために、微小血管および臓器特異的な EC も分析する必要があることも付け加えておきます。

すべての関連データは原稿内に含まれています。

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共焦点および蛍光顕微鏡検査は、スイスのベルン大学の顕微鏡イメージングセンター (MIC) によって支援された装置で実行されました。

この研究は、スイス国立科学財団 (SNSF)、助成金番号 310030_182264 から資金提供を受けました。

生物医学研究部門 (DBMR)、ベルン大学、Murtenstrasse 24、3008、ベルン、スイス

アナスタシア・ミルセフ、アラン・デスポン、ジェーン・ショー、ロバート・リーベン、ニコレッタ・ソルヴィッロ

細胞生物医科学大学院 (GCB)、ベルン大学、ベルン、スイス

アナスタシア・ミルセフ

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AM は、概念化、データのキュレーション、正式な分析、調査、方法論、視覚化、元の草案の作成、およびレビューと編集を担当しました。 NS は監督を担当し、概念化、原案の執筆、レビューと編集を支援しました。 RR は資金調達とリソースを担当し、レビューと編集を支援しました。 AD と JS が調査に協力しました。

ニコレッタ・ソルヴィッロへの手紙。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

ミルセフ、A.、デスポント、A.、ショー、J. 他炎症刺激は、動脈ブタ内皮細胞からのヘパラン硫酸の脱落を誘発しますが、静脈ブタ内皮細胞からは脱落を誘発せず、異なる炎症促進性および凝固促進性反応を引き起こします。 Sci Rep 13、4483 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-31396-z

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受信日: 2022 年 12 月 12 日

受理日: 2023 年 3 月 10 日

公開日: 2023 年 3 月 18 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-31396-z

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