塩化亜鉛は中隔形成術後のバイオフィルム予防における抗生物質として有効です

Mar 23, 2023

Scientific Reports volume 13、記事番号: 8344 (2023) この記事を引用

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メトリクスの詳細

挿入された医療機器に関連するバイオフィルム状態の細菌感染は、世界中で大規模な健康問題と経済問題を引き起こしています。バイオフィルム状態では細菌は抗生物質に対する感受性が大幅に低下しますが、最も一般的な治療アプローチは依然として抗生物質に依存しており、抗生物質耐性細菌の現象を悪化させています。この研究では、鼻腔内シリコンスプリント（ISS）のZnCl2コーティングが、廃棄物、汚染、コストを最小限に抑えながら、これらのデバイスの挿入に伴うバイオフィルム感染を軽減し、抗生物質の過剰使用を防止できるかどうかを評価することを目的としました。我々は、マイクロタイターディッシュバイオフィルム形成アッセイ、クリスタルバイオレット染色、および電子顕微鏡および共焦点顕微鏡を使用して、in vitro および in vivo の両方で ISS でのバイオフィルム形成を防止する ZnCl2 の能力をテストしました。 ZnCl2でコーティングされた副木を患者の鼻内細菌叢に配置した場合、治療グループと増殖対照グループの間でバイオフィルム形成が大幅に減少することがわかりました。これらの結果によると、ISS 挿入に関連する感染症は ZnCl2 コーティングを使用することで予防できる可能性があり、それによって抗生物質の過剰使用や乱用が回避されます。

医療機器に関連した感染症は、患者の罹患率と死亡率の増加、および医療サービスへの深刻な経済的損失の主な原因です1。現在、ほぼすべての医学分野における幅広い医療プロセスでは、異物関連感染症 (FBRI) と呼ばれる重篤な感染症を引き起こす可能性のある異物を患者の体内に挿入する必要があります2。これらの感染症の大部分は、挿入された外部医療機器の表面に定着する、特にバイオフィルム状態の細菌によって引き起こされます。医療機器の感染は通常、患者の皮膚または粘膜に由来する少数の細菌の接種の結果として埋め込み手順中に発生します。しかし、ワクチン接種は、外科スタッフの手、汚染された消毒剤、病院の環境から発生する可能性もあります 2,3。

鼻中隔手術（鼻中隔形成術）は、湾曲した鼻中隔を矯正する外科手術であり、顔面外科手術において最も一般的な外科手術の 1 つです4、5、6、7。 ISS は、手術した鼻中隔と残りの軟骨を安定させ、粘膜の治癒を促進し、鼻合管を予防するために、鼻中隔形成術でよく使用されます 8、9、10。鼻副木関連感染症に関連する最も一般的な微生物は、黄色ブドウ球菌、緑膿菌、肺炎桿菌、およびエンテロバクターアエロゲネスであり、主にバイオフィルムの形態で存在します。

バイオフィルムは、自己生成する細胞外ポリマー物質 (EPS) のマトリックス内に埋め込まれた微生物の組織化された集合体であり、生物または非生物の表面に付着し、可逆的付着、不可逆的付着、成長および分化の複雑かつ動的なプロセスで形成されます。と普及13. バイオフィルムの状態により、細菌間のプラスミドの交換が合理化され、その一部には多剤耐性コード遺伝子が含まれることがよくあります。したがって、バイオフィルムは抗生物質耐性菌を増加させる危険性もあります 14,15。

バイオフィルムの発生後に感染が急速に悪化する可能性が高いことを考慮すると、機器関連の感染制御の基本原理は、治療ではなく予防に依存しています14,16。現在、抗生物質は医療機器関連感染症の最も一般的な治療法です2,17。しかし、バイオフィルム状態では細菌の抗生物質に対する感受性が低下しているため 18、これらの感染症の治療では、多くの場合、埋め込まれたデバイスを取り外し、可能または必要な場合は新しいデバイスと交換する必要があります 2,19。現在、鼻手術後の主な処置は予防的抗生物質の全身投与であるが、それが効果的であると広く合意されているわけではない11,20。細菌感染症の 70% 以上は、感染症の根絶に一般的に使用される 1 つ以上の抗生物質に耐性があることが知られています 21。その結果、細菌およびバイオフィルム状態の細菌感染を予防するための代替抗菌物質および代替治療アプローチの大規模な探索が行われてきました 2,16,22。医療機器に関連するバイオフィルムの形成を防ぐための重要な戦略は、医療機器の表面に抗菌剤や癒着防止剤を塗布する表面改質です 22,23。抗生物質の上記の欠点を考慮して、現在の傾向は、金属ベースのコーティングなど、医療機器用の非抗生物質コーティングの開発です。

金属は、日常生活、産業、農業、医療において抗菌剤として数十年にわたって使用されてきました。特定の金属は、すべての生物の生命の生化学にとって極めて重要であり、有機分子では代替できない細胞機能を果たしているため、必須金属として認識されています。その中で最も一般的な抗菌元素は亜鉛、銀、銅です26、27、28。 29. しかし、亜鉛は高濃度で存在すると細菌細胞の必須反応を阻害するため、細菌細胞にとっても有毒です 30,31。亜鉛は、広範囲の抗菌作用および抗バイオフィルム活性を有することが知られており、さまざまな細胞プロセスに干渉し、その増殖を効果的に阻害することで多くの細菌株に影響を与えます 30,31。塩化亜鉛 (ZnCl2) には抗菌作用と抗バイオフィルム作用があることがすでに示されています 32,33 が、私たちの知る限り、医療機器関連の感染症の予防や治療には利用されていません。

私たちは、医療機器に ZnCl2 コーティングを使用すると、廃棄物、汚染、コストを最小限に抑えながら、これらの機器の挿入に伴う細菌感染を軽減し、不必要な抗生物質の使用を防ぐことができると仮説を立てました。この研究は、ZnCl2 コーティングの医療機器応用モデルとして鼻副木に焦点を当てたものであり、したがって、我々の目的は次のとおりでした。(1) 臨床的に分離された細菌に対する ZnCl2 の抗菌および抗バイオフィルム活性を in vitro で調査すること。 (2) ZnCl2 でコーティングされたスプリントの抗菌および抗バイオフィルム活性を in vitro で調査する。 (3) ZnCl2 の長期存在の影響を調査し、生体内での局所的または全身的な毒性の可能性を排除する。 (4) ZnCl2 でコーティングされたスプリントの in vivo での有効性を評価する (予備研究)。

黄色ブドウ球菌株は、浮遊細胞とバイオフィルム細胞の両方で ZnCl2 に感受性があることが判明し、0.9 ～ 7.0 mM の範囲の ZnCl2 濃度を与えると生存率の大幅な低下を示しました (表 1)。浮遊細胞の場合、最小発育阻止濃度 (MIC) 値は両株とも ZnCl2 濃度 1.2 mM で得られ、最小殺菌濃度 (MBC) 値は 5.0 ～ 7.0 mM の範囲でした。バイオフィルム細胞の場合、バイオフィルム予防濃度 (BPC) 値は 0.9 ～ 1.0 mM の範囲でした。 E. aerogenes 株は、バイオフィルム細胞と浮遊細胞の両方に対して ZnCl2 に対して感受性があることが判明しました。 BPC は両方の株で 2.0 mM で得られ、MIC 値は 3.0 ～ 4.0 mM の範囲でしたが、テストされた範囲内では MBC は見つかりませんでした。緑膿菌株については、両方の株について BPC が 4.0 mM で得られました。ただし、テストされた範囲内の浮遊細胞については、MIC または MBC 値は見つかりませんでした。

3 つの異なる臨床細菌株、緑膿菌、E. アエロゲネス、および黄色ブドウ球菌の ZnCl2 コーティング副木上のバイオフィルム形成は、非細菌の陽性増殖対照と比較して、55 ～ 70% 有意に (p < 0.001) 阻害されました。 ZnCl2 コーティングされたスプリント (データは示されていません)。阻害は首尾よく達成され、168 時間のインキュベーションにわたって一貫しており、有意な差はありませんでした。

CLSM を使用して、3 つの異なる臨床細菌株、黄色ブドウ球菌、緑膿菌、および E. アエロゲネスの、ZnCl2 コーティングされたスプリント上および陽性増殖対照としての非 ZnCl2 コーティングスプリント上でのバイオフィルム形成を評価しました。スプリント表面上のバイオフィルムの成長は、2 つの方法を使用して評価されました。1 つ目は、細菌によって覆われた面積 (%) によって、スプリント表面に付着する細菌の能力を定量化します。2 つ目は、平均シグナル強度によって、バイオフィルムの量を定量化します。。細菌によって覆われた測定面積 (%) (図 1、右列) から、黄色ブドウ球菌と大腸菌エアロゲネスの両方において、ZnCl2 コーティングされたスプリントとそうでないスプリントの間でスプリント表面への付着能力に有意な差は見つかりませんでした。 -ZnCl2 コーティングされたスプリント。この能力の有意な低下（p < 0.01）が緑膿菌で示されました。すべての株は、ポリマーのみでコーティングされたスプリントと比較して、ZnCl2 でコーティングされたスプリント上の平均バイオフィルム量の有意な減少を示しました（黄色ブドウ球菌および緑膿菌：p < 0.01、E. アエロゲネス：p < 0.05）。 .1の左欄と図2）。

CLSM によって評価された、細菌バイオフィルムで覆われた面積 (%) および in vitro でのバイオフィルムの平均シグナル強度。黄色ブドウ球菌 (a、b)、緑膿菌 (c、d)、およびエンテロバクターアエロゲネス (e、f) バイオフィルムを、ZnCl2 コーティングされたスプリント上および陽性増殖対照として ZnCl2 を含まない非 ZnCl2 コーティングスプリント上で増殖させました。これらのスプリントの一部をヨウ化プロピジウム (PI) で染色し、細菌バイオフィルムで覆われた各部分の面積 (右の列) とスプリント表面に形成されたバイオフィルムの量を定量化する平均シグナル強度 (左の列) について CLSM によって評価しました。）。 P 値は、対応のない t 検定によって提供されます (*p 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001)。

CLSM によって評価された、in vitro での細菌バイオフィルムの共焦点生成。 Enterobacter aerogenes (a、d)、Pseudomonas aeraginosa (b、e)、および Staphylococcus aureus (c、f) バイオフィルムを、陽性増殖対照として ZnCl2 コーティングされたスプリントおよび非 ZnCl2 コーティングスプリント上で増殖させました。これらの副子の断片をヨウ化プロピジウム (PI) で染色し、CLSM によって評価しました。

3 人の患者の鼻腔から ZnCl2 でコーティングされたスプリントを取り外した後、CLSM を使用してスプリント片の細菌に覆われた面積 (%) を評価し、スプリントの表面に付着する能力を定量化し、平均シグナル強度を評価しました。バイオフィルム質量の量。負の成長制御のために、スプリントを除去する前に 7 日間抗生物質による予防投与を受けた 2 人の患者の鼻腔から定期的に使用されている非 ZnCl2 コーティングスプリントを使用し、同じ基準を使用して CLSM によって評価しました。すべての治療患者は、対照患者 1 と比較して、ZnCl2 コーティングスプリントの平均シグナル強度で 67% 以上の有意な減少 (p < 0.05) を示しました (図 3a および 4)。しかし、治療患者と対照患者 2 の間には有意差は見つかりませんでした。細菌で覆われた面積 (%) では、3 つの治療グループ間に有意差は見つかりませんでした (図 3b)。対照患者 1 と治療患者 2 および 3 の間、および対照患者 2 と治療患者 3 の間で細菌によって覆われた面積 (%) を比較すると、有意な (p < 0.05) 減少が見つかりました。

CLSMによって評価された、生体内、副木上、挿入後のバイオフィルム増殖の平均シグナル強度(a)および細菌によって覆われた面積(%)(b)。 3 人の患者 (治療患者) の鼻から採取した ZnCl2 でコーティングされた副木片と、予防的抗生物質を投与された 2 人の患者 (陰性増殖対照) の鼻から採取した非 ZnCl2 でコーティングされた副子を、CLSM 評価のために PI で染色しました。スプリント片の平均シグナル強度を評価し、スプリント表面上の細菌増殖量 (a) と各片の細菌増殖で覆われた面積 (%) を定量化しました (b)。 Tukey の正直有意差 (HSD) 検定に従って互いに有意差がない結果は、同じ文字の下にグループ化されます (p < 0.05)。

CLSM によって評価された、挿入後の副子上の生体内での細菌バイオフィルムの共焦点生成。 3 人の患者（治療患者）の鼻から採取した ZnCl2 でコーティングされた副木片（a ～ c）、および予防的に抗生物質を投与された 2 人の患者（陰性増殖対照）の鼻から採取した非 ZnCl2 でコーティングされた副子（d、e） PIで染色し、CLSMで評価しました。

3 つの異なる臨床細菌株のバイオフィルム形成を走査型電子顕微鏡 (SEM) を使用して評価しました。黄色ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌、緑膿菌は、ZnCl2 被覆副木の陽性増殖対照と比較して、ZnCl2 被覆副木上で細菌を増殖させた場合に抑制されました (図 5)。すべての細菌株は、ZnCl2 でコーティングされた副木では低い細菌負荷を示し、ZnCl2 でコーティングされていない副子では高い細菌負荷を示しました。

ZnCl2 コーティングされたスプリントと非 ZnCl2 コーティングされたスプリント上の臨床細菌のバイオフィルム成長を SEM で撮影。黄色ブドウ球菌 (a ～ d)、エンテロバクターアエロゲネス (e ～ h)、および緑膿菌 (i ～ l) を、ZnCl2 でコーティングした副子 (b、d、f、h、j、l) 上で 48 時間増殖させ、陽性増殖させた。対照の非 ZnCl2 コーティング副木 (a、c、e、g、i、k)。画像は、加速電圧 2 kV、倍率 1000 (a、b、e、f、i、j) および 10,000 (c、d、g、h、k、l) で撮影されました。

3人の治療患者の鼻腔から7日間の期間後に抽出されたすべてのZnCl2でコーティングされた副子は、手術後に副子の表面に付着したままの血球とともに、低い細菌量を示しました（図6a〜i）（図6a〜i）。 6a)。対照患者1のZnCl2でコーティングされていない副子（図6j〜l）は、中程度の細菌量を示し、桿菌（図6k）と球菌（図6l）の2種類の細菌コロニーを示しました。対照患者 2 (図 6m–o) は、低い細菌量を示しました。

患者の鼻腔内に7日間放置した後、臨床患者から採取した副子をSEMで撮影したもの。中隔形成術後、ZnCl2 でコーティングされた副子 (a ～ i) が 3 人の患者の鼻腔に 7 日間挿入されました。 ZnCl2 でコーティングされていない通常の副子 (j-o) が、予防的抗生物質治療を受けている 2 人の患者の鼻腔に 7 日間挿入され、陰性成長対照として使用されました。副子は患者の鼻腔から取り外され、SEM で撮影されました。治療患者 1 (a ～ c)、治療患者 2 (d ～ f)、治療患者 3 (g ～ i)、対照患者 1 (j ～ l)、および対照患者 2 (m ～ o)。画像は、加速電圧 2 kV、倍率 1000 (左列)、10,000 (中列)、および 20,000 (右列) で撮影されました。

鼻粘膜における病理学的臨床徴候も組織学的差異も、ZnCl2 被覆スプリント治療群と非 ZnCl2 被覆スプリント治療群との間で観察されなかった（データは示さず）。

ここ数十年間の抗生物質の乱用と誤用により、抗生物質耐性菌株が急速に増加しており、その結果、代替の抗菌物質を探索する必要性が高まっています 2,22,34。有効であると広く合意されているわけではありませんが、中隔形成術における抗生物質による予防は、手術部位に関連した感染症を予防するための一般的な処置です 11,20。最近の研究 11 では、予防的抗生物質療法に関係なく、ISS 挿入後に細菌の増殖が起こり、抗生物質耐性菌の増加が見られることが示されており、中隔形成術における予防治療として抗生物質による予防的使用に代わる緊急性が積極的に示されています。したがって、我々は、通常の ISS の代替品として、非抗生物質で抗菌性の ZnCl2 コーティングされたスプリントを導入することにより、抗生物質の使用を回避することを提案します。私たちの知る限り、これは、抗生物質を投与せずに生体内でテストされた、ISS 用の天然抗菌コーティングの最初の研究です。

本研究では、in vitro と in vivo の両方で、中隔形成術後の感染に対する予防的抗菌治療としての ZnCl2 コーティング鼻副木の利用を検討しました。私たちの研究では、(1) 予防的抗生物質を使用せずに、ZnCl2 でコーティングされたスプリントを患者の鼻内細菌叢に配置した場合、治療患者と陰性増殖対照患者の間で細菌の増殖が減少すること、および (2) ZnCl2 が危険な抗生物質耐性菌と考えられる病原体の細菌の増殖を抑制します。

この研究の重要な発見は、ZnCl2 が、臨床的に分離された 3 つの病原体、黄色ブドウ球菌、緑膿菌、エンテロバクターアエロゲネスすべてのバイオフィルムの成長を阻害できたことです。これらの病原体はすべて、WHO によって抗生物質耐性菌として人類にとって大きな脅威であると考えられています。それらに対する新しい抗生物質の発見の緊急性に関して最高の「優先順位」が与えられました34。試験したすべての病原体のバイオフィルムの成長は抑制されましたが、グラム陰性菌にはグラム陽性菌よりも高濃度の ZnCl2 が必要でした。したがって、グラム陽性黄色ブドウ球菌のバイオフィルムの成長は、0.9 mM ～ 1.0 mM の低い ZnCl2 濃度で阻害されましたが、グラム陰性緑膿菌およびエンテロバクターアエロゲネスにおけるバイオフィルムの成長の阻害には、2.0 mM ～ 4.0 mM のより高い ZnCl2 濃度が必要でした（表 1）。。グラム陰性菌はグラム陽性菌よりも耐性があり、グラム陽性菌に対して開発された化合物のごく一部だけがグラム陰性菌に対して活性を持っているため、この発見は驚くべきことではありません35。したがって、グラム陽性菌とグラム陰性菌の両方を阻害する ZnCl2 の能力は、この研究の重要な発見です。

in vitro の結果では、非 ZnCl2 コーティングスプリントの陽性増殖対照と比較して、ZnCl2 コーティングスプリント上での臨床細菌のバイオフィルム形成が 55 ～ 70% 有意に (p < 0.001) 減少しました (データは示さず)。阻害は 168 時間の試験期間中持続し、患者の鼻腔内での 1 週間の滞在を通じて副子上でのバイオフィルムの成長が効果的に阻害される可能性があることを示しています。 ZnCl2を含まないポリマーでコーティングされた副子と、コーティングされていない市販の副子では、2つの異なる副子上でのバイオフィルム形成に有意な差は見られず、ポリマーコーティングの表面構造が細菌の表面付着能力に大きな影響を与えていないことを示唆している。 in vivo での有効性試験の前に、ラットでの毒性評価が行われました。その結果、ZnCl2 コーティングされたスプリント治療グループと非 ZnCl2 コーティングされたスプリント対照グループとの間で、鼻粘膜に病理学的臨床徴候や組織学的差異は見つかりませんでした（データは示されていません））。

毒性が否定された場合、我々は、ZnCl2 でコーティングされた副子を 3 人の患者の鼻腔に挿入することにより、生体内での有効性を試験し続けました。定性的評価ではなく定量的評価を得るために、CLSM を使用して副子の顕微鏡検査を実行しました。すべての患者間で大きな差はありませんが、ZnCl2 でコーティングされたスプリント表面に細菌が付着する能力は、予防的抗生物質治療を受けた患者から得られた通常の非 ZnCl2 コーティングスプリントよりも低く、負の増殖制御を示しています (図 1)。 5)。しかし、対照患者 1 と 3 人の治療患者の間で、バイオフィルム量を定量化する平均シグナル強度が 66 ～ 72% 有意に (p < 0.05) 減少し、有意ではない減少が 57 ～ 72% 減少していることがわかりました。 3 人の治療患者と対照患者 2 の間のバイオフィルム量は 64% でした。ポリマーインプラント表面でバイオフィルム関連感染が発生する確率は 65 ～ 80% であるため、これは予想されることです 36。しかし、たとえ細菌が表面に付着できたとしても、ZnCl2 コーティングは患者の鼻腔内での 1 週間の滞在中にスプリント表面へのバイオフィルムの成長を抑制し、その結果、必要なく ISS 挿入関連感染症に対する効果的な治療が可能になりました。予防的抗生物質の場合、治療は少なくとも抗生物質と同等の効果があります。

結論として、私たちの予備研究から、ZnCl2 は、ISS 挿入後の予防的抗生物質療法の使用を回避しながら、抗生物質耐性菌として危険であると考えられている病原体のバイオフィルムの成長を阻害できる、天然で効果的かつ安価な解決策であるようです。中隔形成術手術の一環として。統計的には有意ではありますが、このソリューションを臨床現場で実施するには、より多くの被験者を検査する必要があり、コーティングに技術的な改善を加える必要があることを考慮する必要があります（より均一な広がり、使いやすさの向上、コーティングの持続性の向上））。

この研究で使用した細菌は、ハシャロン病院 (Petah Tikvah 4937211、イスラエル) の微生物部門から入手し、分離し、-80 °C で保存しました。すべての細菌は、ISS 除去後に抗生物質で治療を受けた患者と治療を受けなかった患者の鼻内細菌叢から分離されました (表 2)。全ての株を、溶原性ブロス（LB）（Difco）または1.5% Bacto-Agarを含む固体LB培地（Difco）中で増殖させた。 LB ブロスには、1 リットルあたり 10 g のトリプトン、5 g の酵母エキス、および 5 g の塩化ナトリウム (NaCl) が含まれていました。ルーチンの増殖では、固体 LB 上で 37 °C で 24 時間、各株を増殖させました。その後、各菌株の 1 つのコロニーを 5 mL の液体 LB に接種することによってスターター培養物を調製しました。次に、スターター培養物を 100 rpm で振盪しながら 37 °C で一晩インキュベートしました。次いで、スターターをさらにインキュベートするか、OD600 nm が 0.50 になるまでブロス中で希釈し、分光測光法 (WPA CO8000、Biochrom、ケンブリッジ、英国) を使用して測定し、その後関連する実験培地に 1:100 に希釈しました。浮遊増殖には液体 LB を使用し、バイオフィルム増殖には LB に 1% (v/v) グリセロールと 0.1 mM 硫酸マンガン (MnSO4) を添加して LBGM を調製しました 33。

この菌株の同定は、GeneJET ゲル抽出および DNA Cleanup Micro Kit (Thermo Scientific) と 27F および 1492R プライマー 38 を使用した 16S リボソーム RNA 配列決定法 37 を使用して行われました。サンプルの標準的な DNA シーケンスは、エルサレムのヘブライ大学のアレクサンダーシルバーマン生命科学研究所のゲノムテクノロジー施設によって実行されました。黄色ブドウ球菌およびエンテロバクター・エアロゲネスの場合、OD600 nm は 0.50 ≈ 1 × 108 CFU/ml、緑膿菌の場合、OD600 nm は 0.50 ≈ 1.5 × 108 CFU/ml です。

私たちの研究では、抗菌物質として塩化亜鉛 (ZnCl2) (Sigma-Aldrich、セントルイス、ミシガン州、米国) を 1 M 濃縮溶液として使用し、目的の最終濃度に達するまでさまざまな希釈で増殖培地に添加しました。濃度。

この研究で使用したコーティングされた鼻副木は、マイケル・フリードマン教授の研究室（エルサレムのヘブライ大学医学部薬学部）から入手しました。ポリエチレングリコール４００、所望の溶媒量のエタノール水溶液を、磁気撹拌棒を備えた適切なサイズの化学ビーカーに満たした。内容物は約 35 °C で、安定した渦を生成する速度で混合されました。次に、Klucel™ ヒドロキシプロピルセルロース HF を徐々に加えて適切な湿潤を確保し、ポリマーが完全に溶解するまで 25 °C ～ 35 °C で混合し、透明なスライドガラスに対して視覚的に評価しました。次いで、ＺｎＣｌ２をポリマー溶液に添加し、溶解するまで、または安定な分散液が得られるまで混合した。流動特性は、針のないシリンジから製剤 1 mL を吐出することによって評価されました。最終的に、コーティングは、３０ｃｃのエタノール／Ｈ２Ｏ９：１および１．５ｍＬのＨ２Ｏ中に０．３ｇのポリエチレングリコール４００、０．７ｇのＫｌｕｃｅｌ（商標）ヒドロキシプロピルセルロースＨＦおよび０．５ｇのＺｎＣｌ２を含有した。シリコーン副木（Grimaldi 鼻副子、N5、Exmoor Plastics Ltd、英国）を、配合物をピペッティングし、均一に広げて乾燥させることによって両側にコーティングした。余分なコーティングを除去するか、コーティングの重量を均一にするために追加のコーティングを追加しました。スプリント片を使った実験を行う前に、各面を紫外線 (UV) 放射を使用して 1.5 時間消毒しました。

MIC は、浮遊培養物の目に見える増殖を阻害する物質の最低濃度として定義されます。 MBC は、浮遊培養物の初期接種量を 99.9% 減少させる物質の最低濃度として定義されます 39。 MIC 値を決定するために、Balouiri et al.40 に記載されているように、わずかに変更を加えて、検査した細菌株に対してブロス希釈法を使用しました。簡単に説明すると、各分離株に対してスターター培養物を生成し、48 ウェルプレートで 1:100 に希釈し、ZnCl2 を 0.5 mM から最大 10 mM まで段階的な濃度で各ウェルに添加しました。次にプレートを 37 °C で一晩インキュベートし、翌朝増殖を検査しました。 MIC は、目に見える増殖がなく、ZnCl2 の濃度が最も低かったウェルに従って決定されました。 MBC 値を決定するために、前述のように 40、決定された MIC 値よりも高い濃度の各ウェル 100 μL を固体 LB 上に 37 °C で 24 時間プレーティングしました。次に、プレートの生細胞 (CFU/mL) をカウントし、最初の接種材料の 99.9% が死滅する最低濃度として MBC 値を決定しました。これらの基準が満たされない試験範囲内の濃度については、MIC および MBC が見つからない (NF) と判定されました。アッセイは 3 つの独立した実験で実行され、それぞれの ZnCl2 濃度ごとに 3 回ずつ実行されました。

BPC は、細菌接種と抗菌物質を同時に曝露した場合に、OD650 nm でバイオフィルムの成長を 1 log 減少させる抗菌物質の最低濃度として定義されます 39。 BPC 値を決定するために、前述のとおり 39 にいくつかの変更を加えて感受性アッセイを実行しました。スターターを LBGM 培地で 1:100 に希釈し、96 ウェルプレート (丸底、Nunc™) に入れ、ZnCl2 を 0.1 mM ステップで 0.1 ～ 0.9 mM、および 1.0 mM で 1.0 ～ 4.0 mM の段階的な濃度で添加しました。各 ZnCl2 濃度ごとに 4 つのウェルを備えたステップ。静的条件下で 37 °C で 24 時間インキュベートした後、各ウェル 100 μL を新しい 96 ウェルプレート (平底、Nunc™) に移し、プレートリーダー (ELx808™、 Bio-Tek 機器、米国バーモント州）。 BPC は、増殖において少なくとも 1 log の差を生じた最低濃度のウェルに従って決定されました。アッセイは 3 つの独立した実験で実行され、各 ZnCl2 濃度についてそれぞれ 4 回実行されました。

ZnCl2 でコーティングされたスプリントの 1 cm2 片を、ZnCl2 を含まないコーティングされたスプリント片および陽性成長対照としてのコーティングされていないスプリントとともに、24 ウェルプレート (Nunc™) に配置しました。生成したスターターを LBGM 培地で 1:100 に希釈し、コーティングされた各スプリント片の上側に 150 μL をピペッティングしました。その後、プレートを 37 °C の静的条件でインキュベートし、10 時間、24 時間、48 時間、72 時間、および 168 時間後に副木片のバイオフィルムの成長をチェックしました。バイオフィルムの定量化は、以前に使用されたように 41 、修正を加えたマイクロタイターディッシュバイオフィルム形成アッセイによって達成されました。スプリント片を蒸留水で２回洗浄して浮遊細胞を除去し、その後０．１％（ｗ／ｖ）ＣＶ溶液中で１５分間インキュベートした。その後、蒸留水を使用して汚れ残留物を洗浄し、汚れた部分を室温 (RT) で一晩放置して乾燥させました。次に、30% 酢酸を加えて 15 分間 (RT) CV を可溶化しました。次に、抽出物を新しい平底 96 ウェルプレート (Nunc™) に置き、プレートリーダー (ELx808™、Bio-Tekinstruments、バーモント州、米国) を使用して測定しました。

スプリント表面上のバイオフィルム成長を顕微鏡で視覚化するために、1 cm2 片の非コーティングスプリント、ZnCl2 を含まないコーティングスプリント、および ZnCl2 コーティングスプリントを 24 ウェルプレート (Numc™) に配置しました。生成したスターターを LBGM 培地で 1:100 に希釈し、各スプリント片の上側に 150 μL をピペッティングしました。次に、プレートを 37 °C の静的条件でインキュベートしました。 24 時間のインキュベーション後、150 μL の新鮮な希釈スターターを各スプリントの表面の上側に再度ピペットで取り、プレートをさらに 24 時間、37 °C で合計 48 時間インキュベートしました。その後、前述のように 42、以下に詳述するようにわずかな変更を加えて、細菌株に従って断片を洗浄および固定しました。 8% グルタルアルデヒド原液 (SPI Chem、ペンシルベニア、米国) を再蒸留水 (DDW) で 1:1 に希釈することにより、4% グルタルアルデヒド溶液を固定液として使用しました。実験では内部構造ではなく表面形態に焦点を当てていたため、一般的な 2.5% グルタルアルデヒドおよび 2.5% ホルムアルデヒド溶液よりも 4% グルタルアルデヒド溶液が好まれました。エタノールにより水系バイオフィルムシートが完全に除去されてしまうため、固定後の脱水は風乾で行った。

黄色ブドウ球菌については、予備洗浄を行わずに、各ウェルに 300 μL の 4% グルタルアルデヒドを添加することにより、インキュベーション期間の直後に断片を固定しました。 1時間のインキュベーション後、断片をリン酸緩衝生理食塩水(PBS) 400 μLで1回、DDW 400 μLで1回、静的条件(RT)でそれぞれ10分間洗浄しました。最後に、これらの断片を一晩自然乾燥(RT)させました。サンプルは顕微鏡評価まで 4 °C で保管されました。

Enterobacter aerogenes および Pseudomonas aeraginosa の場合、48 時間のインキュベーション後、静的条件 (RT) でそれぞれ 10 分間、断片を 400 μL の PBS で 2 回、400 μL の DDW で 1 回洗浄することにより、付着していない細胞を除去しました。次に、各ウェルに 300 μL の 4% グルタルアルデヒドを添加し、静的条件 (RT) で 1 時間インキュベートすることによって断片を固定しました。インキュベーション後、静的条件 (RT) で、断片を 400 μL の DDW で 10 分間ずつ 2 回洗浄しました。最後に、これらの断片を一晩自然乾燥(RT)させました。サンプルは顕微鏡評価まで 4 °C で保管されました。

顕微鏡評価の前に、細菌株に関係なく、すべてのスプリント片を 4 つの均等な片に切断し、1 nm の金層 (Au/Pd) (QUORUM Q150T ES) でコーティングし、SEM (日本電子、日本電子) で視覚化しました。 JSM-7800F、東京、日本ショットキー電界放射型走査型電子顕微鏡)。画像は加速電圧 2 kV、倍率 1,000、10,000、20,000 で撮影されました。

治療効果を等級分けするために、画像を高微生物負荷（図５ａ）、中微生物負荷（図６ｋ）、および低微生物負荷（図５ｂ）として特徴付けた。

スプリント表面上のバイオフィルム成長の CLSM 視覚化では、SEM を使用したバイオフィルム形成に対するコーティングされたスプリントの有効性の評価の準備と同じ成長および固定プロトコルを実行しました。 CLSM 評価の前に、固定されたスプリント片をヨウ化プロピジウム (PI) (レニウム) で染色しました。130 μL の PI を 870 μL DDW で希釈して 1 mL の原液を作成し、4 °C で錫箔に保存し、さらにPI 原液を DDW で 1:10 に希釈します。次に、希釈した PI 溶液 300 μL を各ウェルに添加しました。続いて、スズ箔で覆いながら３０分間インキュベートした（ＲＴ）。インキュベーション後、スプリント片を 400 μL の PBS で洗浄し、前述したように顕微鏡評価までスズ箔で覆い、PBS 溶液を 4 °C で放置しました 42。私たちの研究室でのカテーテルの過去の経験と、固定ステップ後にすべての細菌が生きていないことを考慮すると、CV よりも PI が好まれました。

スプリント表面上のバイオフィルムの成長は CLSM (LEICA SP8) によって評価され、蛍光強度はズーム係数 1.28、励起 561 nm、発光 600 ～ 650 nm の乾燥 20 × /0.7 NA 対物レンズを使用して測定されました。 PMTゲインは850[V]。ピクセル形式 1024 × 1024、ボクセルサイズ 0.446 × 0.446 × 2 μm (それぞれ X、Y、Z) (補足情報)。

画像の処理と分析は、次の手順で実行されました。(1) 保存された「.lif」ファイルは、フィジー語マクロ「ImageJ_Export-LIF-as-Individual-Images-master_pmascalchi」43 を使用して、個別の「.tif」ファイルとして保存されました。 (2) ファイルは、テストされたサンプルごとに 8 つの異なる領域で 2 番目のマクロ「area_fraction_analysis.ijm」44 を使用して処理および分析されました。

我々は、ラットの鼻粘膜感染症の予防において、ZnCl2 でコーティングされた副木を使用することの安全性を調査しました。この安全性研究はベイリンソン倫理委員会によって承認され、フェルゼンシュタイン医学研究センター（ペタ・チクヴァ、4,941,492、イスラエル）のフランケル実験研究室で実施された。この研究では 18 匹の雄と雌の Sprague-Dawley (SD) ラットを使用し、標準ガイドラインに従って飼育しました。シリコーン製内部鼻副木 (INS) および ZnCl2 シリコーン被覆副木 (Z-INS) を 1 mm × 0.85 mm × 7 mm 片に切断しました。ラットは、INS が移植された対照群 (n = 6) と Z-INS が移植された治療群 (n = 12) に無作為に割り付けられました。副木をラットの右鼻腔に７日間配置した。次に、組織は脱灰され、トリミングされ、パラフィンに包埋され、切片化され、PATHO-LAB Diagnostics Ltd. (イスラエル、ネスジオナ) の研究部門による組織学的処理に送られました。組織学的評価は、BX43 オリンパス光学顕微鏡およびオリンパス cellSens Entry 1.13 ソフトウェアを備えた DP21 オリンパスデジタルカメラを使用して得られました。 Şevik Eliçora et al.45 に記載されているように、サンプルは既知のパラメーターに従って評価されました。

鼻の手術後、ハシャロン病院（イスラエル、ペタク・チクヴァ、カカル・ストリート7）の外科医は、従来のコーティングされていない副子の代わりに、ZnCl2でコーティングされた副子を3人の患者の鼻腔に挿入した。副子は術後 7 日間患者の鼻の中に放置され、その後除去され、PBS で洗浄され、4% グルタルアルデヒドで固定されました。スプリントを１時間硬化させた後、静的条件（ＲＴ）下でＰＢＳ中で各１０分間２回洗浄した。スプリントを一晩風乾（RT）させ、最後に顕微鏡評価まで 4 °C で保管しました。

この研究に参加した患者は、手術前の1か月間、定期的な投薬、抗生物質による治療、点鼻薬および鼻腐食剤の使用を控えた。

動物実験およびすべての実験プロトコールに対する倫理的承認は、動物モデルにおける感染予防のためのポリマーベースの徐放性亜鉛コーティングデバイスの効果に関する研究について、ラビン医療センター倫理委員会（ヘルシンキ）によって付与されました。承認番号: 021219、期間は 01/12/19 から 4 年間。すべての方法は関連するガイドラインおよび規制に従って実行され、ARRIVE ガイドラインに従って報告されます。

人体研究の倫理的承認は、鼻副子上の細菌の増殖を防ぐためにZnCl2でコーティングされた副子を使用する研究のための人体での第1相試験について、ラビン医療センター倫理委員会（ヘルシンキ）によって承認されました。承認番号: 0374-19-RMC、2021 年 9 月 23 日から 1 年間有効。すべての研究は関連するガイドラインおよび規制に従って実施され、すべての被験者および/またはその法的保護者からインフォームドコンセントが得られました。

得られた数値データは、JMP ソフトウェアを使用した事後 t 検定後の ANOVA によって統計的に分析されました (有意差 p 値 < 0.05)。結果は、三重に実施された 3 つの生物学的実験に基づいています。

この研究の結果を裏付けるデータは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。現在の研究中に生成および/または分析されたデータセットは、NIH リポジトリで入手可能です (アクセッション番号: OQ195154、OQ195155、OQ195156、OQ195157、OQ195158、および OQ195159)。

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この研究は、イスラエルイノベーション庁 (70017) によって財政的に支援されました。

生化学・食品科学・栄養研究所。ロバート・H・スミスエルサレム・ヘブライ大学農学・食品・環境学部、レホヴォト、イスラエル

ノアノア＆ラムタイヤ

コレット獣医学部。ロバート・H・スミスエルサレム・ヘブライ大学農学・食品・環境学部、レホヴォト、イスラエル

エラン・ラヴィ

FACSI-農学部科学画像センター。ロバート・H・スミスエルサレム・ヘブライ大学農学・食品・環境学部、レホヴォト、イスラエル

エイナット・ゼリンガー

エルサレム・ヘブライ大学、エルサレム、イスラエル、薬学部、医学部、アイン・ケレム・キャンパス

マイケル・フリードマン & デヴィッド・カーマイヤー

イスラエル、ペタク・チクヴァ、ラビン医療センター、耳鼻咽喉科、頭頸部外科

アミット・リッター、ダン・ヤニフ、エラ・ライフェン

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NN は主な原稿テキストを書き、EL はプロジェクトを調整し、RR はプロジェクトを設計および管理し、MF と DK は副木サンプルを準備し、EZ は電子顕微鏡および共焦点顕微鏡検査を実行し、AR と DY は臨床追跡調査を実行し、ER は手術を実行しました。著者全員が原稿をレビューしました。

ラム・ライフェンへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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Noach、N.、Lavy、E.、Reifen、R. 他。塩化亜鉛は、中隔形成術後のバイオフィルム予防における抗生物質として効果的です。 Sci Rep 13、8344 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-35069-9

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受信日: 2023 年 1 月 2 日

受理日: 2023 年 5 月 11 日

公開日: 2023 年 5 月 23 日

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